16S rRNA 测序分析流程

科学界从很早就开始认识到微生物对人类健康和生态环境的作用。传统的微生物技术主要针对菌株的分离鉴、培养以及计数等。限于这些微生物学研究的手段，研究人员难以高效地获得样本内，全部的微生物的种类和丰度信息。随着测序技术手段的广泛应用，目前已经有较为成熟的方式获得样本中已知微生物的丰度信息。这就是16S rRNA测序技术。

1. 什么是16SrRNA测序技术？

16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA），简称16S rRNA，是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分。16S rRNA的长度约为1,542 bp。由于该序列在进化上可以很好的区分不同属水平的不同微生物，因此可以作为菌株的区分标志。目前学术界已经有比较成熟公共数据库，对不同菌属的16S rRNA序列进行汇总整理。相关信息见下表

2. 16S rRNA分析步骤

16S rRNA测序可以分为以下基本步骤

• 测序数据质量控制
• 通过Qiime2套件获得菌属定量信息
• 菌属差异分析
• Picrust2通路分析

2.1 数据质量控制

从实验设计角度来讲，一般二代测序即使用双端也难以测通完整的16S rRNA区域，因此二代测序目前的策略都是测一部分可变区域。这导致一般而言无法把所测得的序列定位到种的水平，由于这种序列长度限制，因此一般都会将测到的序列对应的实体称为OTU（ operational taxonomic units）。

由于16S rRNA序列是和菌属的对应关系，因此在开始下游分析之前，需要对测序质量较差的序列进行过滤以保证菌属鉴定的有效性。

2.2 Qiime2 套件分析

Qiime2是目前16S rRNA测序方面较为公认的数据处理工具盒，其中整合了数据基本处理、OTU聚类、多样性统计（α多样性、β多样性）差异分析等基础功能。

这里值得需要注意的是，在差异分析部分，从文献报道来看，尚无非常有效的方式。尤其是不同方式直接差异还是比较大的。因此一般都会将差异部分单独来进行处理，相对常见的如采用LEfSe，进行。

2.3 菌属差异分析

LEfSe分析即LDA Effect Size分析，可以实现多个分组之间的比较，还进行分组比较的内部进行亚组比较分析，从而找到组间在丰度上有显著差异的物种。

2.4 PICRUST 通路分析

菌属之间的分类差异，意味着其所携带的基因和对应生物学功能以及代谢通路上的差异，PICRUST是为了分析这些差异而产生的分析工具，其原理利用了菌属之间的进化关系，对基因实体丰度进行了估计，进而将对应的生物学通路进行了定量，以表征不同样本之间的在代谢和功能上的差异。

3 小结

除了二代测序之外，三代测序也有针对微生物的扩增子测序方案。但是其应用上目前还是受限于三代测序价格和数据库等因素，普及程度不如二代测序广泛。

但是二代测序在定量和差异稳定性方面依然存在一定的问题，今后有机会可以跟大家分享在16S rRNA差异菌属鉴定方面的一些内容，欢迎大家持续关注。